2025年，由斯坦福大学地球系统科学系领衔的研究团队，借助丹麦 KC-Denmark 公司的孔隙水压榨台（Pore-Water Pressing Bench），在加利福尼亚州蒙特雷湾（Monterey Bay）的两处冷泉渗漏区开展系统采样与深度测序解析，首次对这片被研究三十余年却始终缺乏微生物学表征的海区进行群落刻画，揭示了甲烷渗漏沉积物中厌氧甲烷氧化古菌（ANME）异常稀缺的现象。相关成果于 2025 年 1 月发表于《Biogeosciences》。

图1. 丹麦KC-Denmark公司孔隙水压挤装置

图2. 蒙特雷湾两处冷泉站点位置与 ROV 采样现场。(a) 蒙特雷湾水深图及 Clam Field（CF，895–909 m）与 Extrovert Cliff（EC，965–990 m）两站点位置，插图为中心加州海岸；(b)(c) Clam Field 采样前后的 ROV Doc Ricketts 影像，可见密集的活体蛤床与斑块状微生物席；(d)(e) Extrovert Cliff 采样前后的 ROV 影像，白色箭头指向推入式柱样

研究背景

冷泉（cold seep）是海底以甲烷和硫化物为主的流体渗漏所形成的化能合成生态系统。在全球范围内，冷泉微生物群落具有高度可预测性，即所谓“渗漏微生物组”（seep microbiome），其核心成员是厌氧甲烷氧化古菌（anaerobic methanotrophic archaea，ANME）与硫酸盐还原细菌（sulfate-reducing bacteria，SRB）构成的共生体。ANME 通过将甲烷的厌氧氧化（anaerobic oxidation of methane，AOM）与硫酸盐还原相耦合，被认为可在甲烷抵达海底前氧化其中约 80%，是海洋甲烷的关键“生物过滤器”。

蒙特雷湾位于构造活跃的转换边界上，圣格雷戈里断裂带与蒙特雷湾断裂带贯穿其间，富有机质的含烃沉积物被持续挤压、压实，驱动流体沿高孔隙层与渗透性裂缝上升，形成密集的冷泉网络。该区域的流体化学与大型底栖动物已被研究三十余年，历史上曾在此检出 ANME-2b、ANME-2c 的克隆，然而基于荧光原位杂交的定量调查始终未能成功，具备典型 ANME 聚合形态的细胞亦十分罕见。为此，作者选择 Clam Field（895–909 m）与 Extrovert Cliff（965–990 m）两个站点，首次以深度扩增子测序系统刻画其微生物群落与孔隙水地球化学。

研究过程

2019 年 4 月，研究团队搭乘 R/V Western Flyer 科考船，使用 ROV Doc Ricketts 在两地采集沉积物柱样。每个站点沿 100 m 样带布设四个位置：渗漏中心、渗漏内缘、边界外 5 m 与边界外 100 m，分别记为 Seep、Seep-Edge、Background-5m 与 Background-100m，每个位置取两根最长 20 cm 的推入式柱样（push core）。柱样回收后于 4 °C 保存，并在采集后 8 h 内挤出、切片：0–10 cm 以 2.5 cm 间隔分层，10 cm 以下以 5 cm 间隔分层。

孔隙水的提取是整个流程中最关键的一环。沉积物切片后，立即在氩气流保护下使用孔隙水压榨台（KC Denmark Research Equipment, Silkeborg, Denmark）挤出孔隙水，并经 0.2 µm Durapore PVDF 滤膜过滤。其中 0.5 mL 以 0.5 M 乙酸锌固定、4 °C 保存用于硫化物测定，2 mL 加入预置 1 mL 85% 磷酸并已抽真空、N₂ 吹扫的 Exetainer 管中，用于溶解无机碳（DIC）的 δ¹³C 分析。甲烷由气相色谱-火焰离子化检测器测定并按孔隙度回算为孔隙水浓度，硫化物采用亚甲基蓝比色法（Cline, 1969）测定，检出限 0.02 mM。

分子层面，团队对 16S rRNA 基因 V4–V5 区（515F-Y/926R 引物）与甲基辅酶 M 还原酶基因 mcrA（mcrA_F/mcrA_R 引物）同步开展 DNA 与 RNA（cDNA）扩增测序，并以微滴式数字 PCR（ddPCR）定量 mcrA 基因与转录本，配合 DAPI 染色显微计数 ANME 典型聚集体。此外，Clam Field 沉积物在 0–2 atm 甲烷、100 µM ¹⁵NH₄⁺ 条件下培养 6 个月，以考察甲烷氧化类群及其硫酸盐还原共生体的富集潜力。

图3. 采样方案与地球化学剖面。(a) 两站点统一的柱样布设示意（非等比），自渗漏中心沿 100 m 样带依次为 Seep、Seep-Edge、Background-5m 与 Background-100m；(b) 全部柱样甲烷、硫化物浓度与 δ¹³C-DIC 随沉积深度的热图，BDL 表示低于检出限

实验结果

甲烷与硫化物显著富集，但 δ¹³C-DIC 异常偏重。 Clam Field 孔隙水甲烷浓度为 25–183 µM，随深度递增，约为背景沉积物的 4 倍；Extrovert Cliff 甲烷高达约 3000–6400 µM，比 Clam Field 高出约 2 个数量级。两地渗漏边界内硫化物亦明显升高，Clam Field 由表层未检出升至 11.2 mM，Extrovert Cliff 全剖面维持 2.7–12.7 mM。Clam Field 的 δ¹³C-DIC 随深度由 −3.1‰ 降至 −17.7‰，明显重于典型活跃甲烷氧化冷泉（通常为 −40‰ 至 −30‰），暗示其 DIC 更多来自非甲烷烃的氧化（Fig. 2b）。

mcrA 基因与转录本丰度极低。 Extrovert Cliff 渗漏沉积物的 mcrA 基因峰值出现在 2.5–5 cmbsf，达 5.3 × 10⁷ copies g^-1 干沉积物；Clam Field 峰值仅 4.2 × 10⁶ copies g^-1，且其 mcrA 转录本与背景沉积物相当。按 mcrA 基因丰度与 ANME 占比换算，Extrovert Cliff 的 ANME 细胞数约 8.2 × 10⁶–4.7 × 10⁷ cells g^-1，而 Clam Field 仅 4.5 × 10²–8.2 × 10⁴ cells g^-1，两地相差约 4 个数量级（Fig. 3、Fig. 5）。

图4. Seep 与 Background-5m 柱样中甲烷、计算硫酸盐浓度（折线）与 mcrA 基因（DNA）、转录本（cDNA）浓度（条形）随深度的分布。注意 Extrovert Cliff Seep 面板中甲烷浓度横轴量级不同；n.d. 表示已测定但未检出

ANME 在群落中近乎缺失，且培养无法富集。 Clam Field 中 ANME 序列占比不足 0.1%，Halobacterota 的 cDNA 完全未检出；Extrovert Cliff 的 ANME 虽不足 0.3%，但转录活性很高，cDNA 中最高可达约 18%，且几乎全部来自 ANME-2c，其潜在共生伙伴 Seep-SRB2 在 5–7.5 cmbsf 的 cDNA 中占比高达 30%。Clam Field 沉积物经 6 个月甲烷培养后 ANME 未见富集，硫化物虽有累积但与是否添加甲烷无关，表明硫酸盐还原并不依赖甲烷（Fig. 4）。

图5. 群落组成随深度的变化。(a) 各沉积层位古菌与细菌门水平的相对丰度；(b) Halobacterota 内甲烷循环亚群与 Desulfobacterota 内硫酸盐还原亚群的相对丰度，分别以 DNA 与 cDNA 推断

孔隙水甲烷呈线性剖面，指示生物氧化微弱。 Clam Field 甲烷浓度沿岩心近似线性下降，而非指示 AOM 的凹形曲线。若仅以扩散为去除机制，估算 Clam Field 的 Seep 与 Seep-Edge 柱样甲烷扩散通量分别为 17.8 与 18.5 mmol CH₄ m^-2 yr^-1，这部分甲烷可能直接逸出至水柱（Fig. 2b）。

图6. mcrA 基因测序所得各 ASV 的相对丰度及其在 mcrA 参考树上的分布。Clam Field 以甲基营养型产甲烷菌 ASV.2 为主，Extrovert Cliff 则以 ANME-2c 为优势类群；实心圆表示自举支持度≥60%（灰）或≥80%（黑）的节点

研究结论

第一，蒙特雷湾冷泉存在 ANME 古菌异常稀缺的现象，Clam Field 尤为突出：高甲烷、高硫化物与典型的渗漏宏体生物群落，并不足以保证活跃的厌氧甲烷氧化。第二，非甲烷烃（乙烷、丙烷、丁烷及可见油类）的输入可能直接或间接排除了 ANME——非甲烷烃氧化每还原 1 mol 硫酸盐的产能高于 AOM，且无需在两个共生伙伴之间分配能量，因而可能在与烃降解细菌的竞争中占据优势。第三，冷泉甲烷氧化效率存在显著的站位差异，且无法由表面宏体生物群落或渗漏表面形态推断，这对全球甲烷排放估算具有直接意义。

上述结论的可靠性，很大程度上取决于孔隙水是否真正在无氧条件下原位提取。铁、硫、甲烷等氧化还原敏感组分一旦接触空气即被迅速改写，δ¹³C-DIC 与硫化物剖面也会随之失真。本研究所用 KC-Denmark 孔隙水压榨台采用 5 个 100 mL 压榨室，最大工作压力 4 bar（400 kPa），适配样品直径 ≤ 40 mm；压榨室标配黑色聚甲醛（POM），亦可定制 AISI 316 不锈钢。该设备可整体置入手套箱，在氩气或氮气保护下完成孔隙水的分级提取，从切片到挤出的每一步都隔绝氧气，这正是本研究能够获得可信地球化学剖面的前置条件。

图7. 基于加权 UniFrac 距离的非度量多维尺度（NMDS）排序。(a)(b) 仅渗漏样品，颜色分别表示站点与沉积深度；(c)(d) 含背景样品，蒙特雷湾背景样品嵌入美国大西洋边缘背景群落之中

参考文献

Semler, A. C., Dekas, A. E. Unexpected scarcity of ANME archaea in hydrocarbon seeps within Monterey Bay. Biogeosciences, 22(2): 385–403, 2025. https://doi.org/10.5194/bg-22-385-2025

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